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植物遗传转化主要涉及两个关键步骤：转化（将目的基因转移并在宿主细胞中表达）和再生（阳性转化细胞形成完整植株）。通过提高转化和再生效率可以有效的打破许多植物遗传转化的瓶颈。在先前的推文“显著提高遗传转化效率，只需一步！（一）、（二）、（三）”中，小远主要从再生的角度出发给大家介绍了许多可以提高植物再生效率的基因。在本次的推文中，小远则想和大家一起来看看通过哪些方法可以提高目的基因的转化效率。
PART.01
利用T3SS分泌系统改造农杆菌
农杆菌介导的遗传转化被广泛应用于转基因植物的基础研究和商业育种中。在先前的推文“说说那些隐秘往事.”中，小远给大家介绍过根癌农杆菌是利用自身的四型分泌系统T4SS将T-DNA及毒力蛋白转移至宿主细胞，毒力蛋白进一步帮助T-DNA整合到植物基因组中。但是，目前还有很多植物对农杆菌的侵染不敏感，主要是因为农杆菌侵染会激发这些植物的防御反应，从而被抑制。而具有三型分泌系统T3SS的丁香假单胞菌，则可以利用T3SS将三型效应因子T3Es运送到植物体内，这些T3Es可阻断植物的防御反应细菌在植物内生长繁殖。
2022年5月，美国诺贝研究所的Kirankumar S. Mysore课题组在
Nature Communications
杂志上发表了一篇题为“
Agrobacterium
expressing a type III secretion system delivers Pseudomonas effectors into plant cells to enhance transformation”的研究论文，该研究发现在根癌农杆菌中正常表达的T3SS编码基因，可通过向植物细胞递送T3Es或植物蛋白H2A-1，显著提升根癌农杆菌介导的植物遗传转化效率。
作者首先通过分泌实验和共聚焦显微镜观察，证实了丁香假单胞菌的T3SS可在根癌农杆菌中行使功能，并递送T3E蛋白AvrPto至侵染的烟草叶片中（图1）。同时表达T3SS和AvrPto不仅可以显著提高根癌农杆菌对拟南芥的瞬时侵染能力，还可以使拟南芥浸花转化的效率提高两倍。在本氏烟中也证实了T3SS和AvrPto在根癌农杆菌中的表达显著增加了瞬时和稳定转化效率。使用其他T3Es效应因子，如AvrPtoB、HopAO1，也得到了同样的结果。为了确定改造后的根癌农杆菌是否也可用于提高其他植物的转化效率，作者在小麦、苜蓿和柳枝稷上使用可通过T3SS递送T3Es的工程化菌株进行转化，结果显示这三种植物的转化效率均得到了提升（图2）。
图1 在根癌农杆菌中表达的T3SS可将T3Es递送至植物细胞(Raman et al., 2022)。（a）分泌实验的示意图，将含有T3SS（pLN18）的质粒和标记有
PhiLOV
的
AvrPto
（pBBR1MCS5-AvrPto-PhiLOV）导入根癌农杆菌菌株GV2260，使其表达T3SS和
AvrPto
-
PhiLOV
。
AvrPto
的编码序列包含编码III型分泌信号肽（T3SSsp）的序列；（b）通过免疫印迹法检测工程化根癌农杆菌分泌到培养基中的AvrPto-PhiLOV；（c）在植物体内工程化的根癌农杆菌通过T3SS递送蛋白质的可视化示意图。将pLN18和含有
AvrPto
-
GFP11
的质粒导入根癌农杆菌菌株GV2260，使其表达T3SS和AvrPto-GFP11。在植物细胞中AvrPto-GFP11可与植物中表达的GFP1-10互补形成有功能的GFP产生荧光；（d）瞬时表达GFP1-10的本氏烟草叶片分别注射根癌农杆菌GV2260、GV2260（pLN18）、GV2260（
AvrPto
-
GFP11
）和GV2260（
AvrPto
-
GFP11
，pLN18）后用共聚焦显微观察到的图像。
图2 表达T3SS（pLN18）和T3Es（
AvrPto
、
AvrPtoB
或
HopAO1
）的工程化根癌农杆菌显著提高了小麦、苜蓿和柳枝稷的稳定转化效率(Raman et al., 2022)。
进一步的研究表明，在表达T3SS和T3E的根癌农杆菌菌株中，
virA
、
virB2
、
virD2
、
virE3
等毒力基因的表达没有受到明显的影响。而根癌农杆菌通过T3SS递送的AvrPto可抑制宿主植物防御性基因的表达，说明T3SS和T3E是通过抑制植物的防御反应来提高根癌农杆菌的侵染能力。
先前的报道表明组蛋白H2A-1（由基因
HTA1
编码）参与了T-DNA的整合，
HTA1
或截短的
HTA1
（
tHTA1
）在植物中的过表达可提高转化效率(Mysore et al., 2000; Tenea et al., 2009; Zheng et al., 2009)。利用T3SS同样可以递送这些蛋白，结果显示同时表达T3SS和H2A-1，或T3SS和tH2A-1的根癌农杆菌可以显著提高拟南芥、烟草、小麦、苜蓿和柳枝稷的遗传转化效率（图3）。总之，利用T3SS改造的农杆菌有助于提高多种植物的转化效率。
图3 表达T3SS（pLN18）和植物组蛋白基因
HTA1
的工程化根癌农杆菌菌株可提高植物稳定转化效率(Raman et al., 2022)。
PART.02
优化农杆菌Ti质粒载体结构
双元载体通常由T-DNA区、细菌选择标记和复制起点（ORI）三部分构成，使质粒能够在农杆菌中正确复制和维持。先前部分研究表明，决定宿主范围及拷贝数的ORI（介导质粒复制的整个DNA序列，包括复制起始和反式作用因子）会影响农杆菌介导的转化效率(Oltmanns et al., 2010; Thomas et al., 2017; Vaghchhipawala et al., 2018; Zhi et al., 2015)。因此，全面筛选ORI变体，有助于更好地了解质粒拷贝数对农杆菌介导的转化的影响。
2024年11月，美国联合生物能源研究所的Patrick M. Shih 和Mitchell G. Thompson课题组在
Nature Biotechnology
杂志上发表了一篇题为“Binary vector copy number engineering improves
Agrobacterium
-mediated transformation”的研究论文，该研究利用高通量生长耦合选择分析和定向进化方法快速识别影响拷贝数的ORI突变，并筛选出了可提高农杆菌介导的转化效率的突变体。
为了系统地从不同ORI中筛选出拷贝数较高的突变体，作者基于RepA蛋白的突变可以改变不同ORI的质粒拷贝数这一特性，利用易错PCR技术（error-prone PCR, epPCR）对pVS1、pSa、RK2和BBR1这四个ORI的整个repA开放阅读框（ORF）进行随机诱变。之后将这些突变后的ORF分别构建到选择载体中，创建了四个突变文库。为了在这些文库中选择拷贝数较高的变异，作者通过定向进化分析，将质粒拷贝数与细菌抗生素耐受性联系起来（图4）。这种与生存相关的筛选方法确定了对野生型（WT）致死但允许突变群体生长的条件，从而在该群体中富集了高拷贝数的突变体。对于每个筛选出的文库，使用Illumina MiSeq对整个群体的repA ORF进行测序，并同时对未筛选的文库进行对照测序，以评估每个RepA残基对生存的选择压力。通过比较未筛选群体和筛选群体中突变分布的频率，可以识别出那些在野生型致死条件下有助于突变体存活的残基。在4个ORIs中，pSa、pVS1、BBR1和RK2分别在38、118、126和150个核苷酸位置上富集2倍。
图4 利用下一代测序技术生成质粒拷贝数变异的定向进化流程(Szarzanowicz et al., 2024)。（a）针对四种ORI的repA诱变方法示意图；（b）棋盘格检测数据示例，以及群体测序策略的示意图。
接着，作者利用瞬时表达实验，在本氏烟中检测了单个repA SNP的影响。对于每个ORI的双元载体除了repA中的单个SNP外，其他都是相同的，因此植物GFP表达的差异可归因于该SNP对农杆菌转化效率的影响。总共筛选了来自所有ORI的71个候选突变体，并且鉴定出了所有四种ORI的突变体，这些突变体相对于其野生型显著增加了GFP表达（图5）。
图5 筛选可提高本氏烟草瞬时转化效率的RepA突变体(Szarzanowicz et al., 2024)。（a）用于筛选71个突变体的本氏烟草瞬时表达检测示意图；（b）箱线图展示了每种突变体载体在本氏烟草叶片中测得的绿色荧光蛋白GFP的表达量（n=48）。
最后，为了评估烟草瞬时表达筛选的结果能否应用到植物稳定转化中，作者对拟南芥进行了稳定转化，结果显示pVS1的R106H突变体使拟南芥的稳定转化效率相较于野生型pVS1提高了60%。RK2和pSa的转化效率提高更为显著，但总体转化效率仍低于pVS1（图6）。
图6 双元载体ORI突变体可提高植物的稳定转化效率(Szarzanowicz et al., 2024)。
PART.03
引入辅助质粒
在双元载体系统和超双元载体系统难以高效转化的情况下，引入额外的辅助质粒形成三元载体系统可以有效提高顽拗型植物的转化效率。2018年4月，陶氏杜邦农业事业部Ajith Anand团队在
Plant Molecular Biology
上发表了题为“An improved ternary vector system for Agrobacterium-mediated rapid maize transformation”的研究论文，该研究开发了一种带有辅助质粒“pVIR”的三元载体系统，此系统弥补了pSB1载体原有的毒力基因缺陷，并增加了毒性基因，简化了载体构建步骤。将辅助质粒pPHP70298与T-DNA双元载体结合起来形成的三元载体，对之前转化效率较低的玉米自交系进行遗传转化，可使转化效率显著增加（图7）。此外，作者对辅助质粒和T-DNA载体上的复制起点进行筛选（图8），鉴定出了四种ORI-by-ORI组合，分别是pSa/pVS1、RK2/pSa、pRi/RK2和pRi/pVS1，它们会使优异玉米自交系的转化效率高达86%-103%。最后，作者在三元载体系统的辅助质粒中还引入形态调节基因
Bbm
和
Wus2
，发现可以有效提高植物遗传转化的效率并缩短转化周期。
图7 pPHP70298改善了玉米中的瞬时和稳定T-DNA转化(Anand et al., 2018)。（A-C）用双元载体pPHP45981（A）、三元载体pSB1/pPHP45981（B）和pPHP70298/pPHP45981（C）转化PH2RT未成熟胚5天后，荧光蛋白的表达情况；（D、E）三元载体pSB1/pPHP45981（D）和pPHP70298/pPHP45981（E）产生的愈伤组织生长情况。
图8 在玉米快速转化系统中测试的不同ORI-by-ORI的示意图(Anand et al., 2018)。（A）用于评估12种不同ORI-by-ORI的三元载体，其中包含基于pPHP79761的辅助质粒，其复制子不同；（B）以pRi（双元质粒）/pVS1（辅助质粒pPHP71539）复制子作为实验对照的三元载体示意图。
PART.04
使用乙酰丁香酮和Silwet-L77
乙酰丁香酮（Acetosyringone, AS）可以激活农杆菌的
vir
基因，在T-DNA转移中发挥重要作用。Silwet-L77是一种有机硅表面活性剂，可以促进微生物通过植物的创伤部位进入组织，增强T-DNA的转移。
2024年4月，中国科学院华南植物园侯兴亮课题组在
Plant Communications
杂志上发表了一篇题为“A simple and efficient
in planta
transformation method based on the active regeneration capacity of plants”的研究论文，在该论文中，作者为了优化RAPID转化体系，除了筛选最适农杆菌和最佳菌液浓度外，还比较了乙酰丁香酮和Silwet-L77的不同组合对农杆菌转化的影响。结果显示，在没有添加Silwet-L77的情况下，转化失败，这表明Silwet-L77对于成功转化至关重要。乙酰丁香酮在促进转化效率方面也有显著的作用，当添加0.02%的Silwet-L77和100µM的乙酰丁香酮时，甘薯的转化效率最高（图9C）。这一结果也进一步证实了乙酰丁香酮和Silwet-L77在提高农杆菌转化效率方面的作用。
图9 RAPID转化方法的优化(Mei et al., 2024)。（A）使用不同农杆菌菌株时的转化效率；（B）不同OD值的农杆菌菌株的转化效率；（C）添加不同添加剂后的转化效率。
PART.05
使用钙离子通道阻滞剂
当农杆菌侵染植物时，植物会发生一系列信号转导事件，包括Ca2 浓度增加，活性氧（ROS）积累，丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）和Ca2 依赖蛋白激酶介导的信号级联激活等(Lamb and Dixon 1997; Boller and Felix 2009)。而Ca2 通道阻滞剂LaCl3能抑制拟南芥防御信号的远距离传输(Toyota, et al., 2018)。基于这些前期的研究，是否可以通过抑制植物对农杆菌的免疫应答来提高农杆菌介导的转化效率。
2022年4月，中国农业大学逯敏慧课题组在
Plant Cell Reports
上发表了一篇题为“LaCl3 treatment improves
Agrobacterium
-mediated immature embryo genetic transformation frequency of maize”的研究论文，在该论文中，作者将玉米自交系ND101的幼胚用不同浓度的LaCl3预处理后，再用农杆菌EHA105进行转化。结果显示，LaCl3预处理幼胚后可显著提高农杆菌的转化效率，其中，用10mM的LaCl3预处理时效果最佳。LaCl3预处理不仅不会影响胚性愈伤组织的形成，还能增加阳性愈伤组织的比例（图10）。经过LaCl3处理后，再生率也从13.20%增加到27.20%，是对照组的两倍。最后，作者用PCR鉴定了阳性T0植株并计算了转化率。结果显示，玉米的转化效率从8.40%提高到17.60%，低拷贝事件效率也从8.00%增加到15.20%（图11）。
图10 用10mM LaCl3预处理玉米未成熟胚可提高愈伤组织的阳性率(Liu et al., 2022)。（A）RFP阳性的愈伤组织在选择性培养基中培养10天，白色星号表示不定芽；（B）RFP阳性愈伤组织的统计结果。
图11 用10mM LaCl3预处理玉米未成熟胚可提高玉米的转化率(Liu et al., 2022)。（A）在再生培养基中培养20天的愈伤组织的形态；（B）再生速率的统计学分析；（C）用PCR检测T0植株的阳性情况；（D）转化率的统计学分析；（E）Bar阳性的T0植株，被移植到营养土中种植。
PART.06
超声处理
超声处理有助于在外植体表面和内部组织产生微小损伤，使农杆菌能够更有效地穿透并转移遗传物质。2022年4月，中国热带农业科学院橡胶研究所黄华孙和华玉伟课题组在
Plants
杂志上发表了一篇题为“Optimization of the Transformation Protocol for Increased Efficiency of Genetic Transformation in
Hevea brasiliensis
”的研究论文，在该论文中，作者从多个方面对巴西橡胶树的遗传转化方案进行了优化，包括了抗生素浓度、预培养时间、农杆菌浓度、超声处理和共培养条件等，开发了一种高效的农杆菌介导的橡胶树转化方法。
作者以橡胶树子叶体细胞胚（Somatic embryos, SEs）作为外植体，使用不同的超声处理时长辅助农杆菌进行转化。在每种处理中，均观察到了SEs中不同水平的GUS表达情况以及形态变化。切片观察证实，如果超声处理时长超过50秒，组织会受到致命影响（图12）。经过多次试验，确定了最佳的农杆菌侵染方式是将SEs在农杆菌悬浮培养液中孵育8分钟，然后进行50秒的超声处理，接着再在相同的液体培养液中静置孵育10分钟（无需摇晃），通过这种方法可以有效的提高农杆菌的转化效率。
图12 经超声处理后巴西橡胶树SEs中的GUS表达情况(Udayabhanu et al., 2022)。（A、E）农杆菌接种8分钟并超声处理10秒，黑色箭头指示维管束中的GUS表达，红色箭头（N）指示未转化区域；（B、F）侵染8分钟并超声处理30秒，黑色箭头指示外植体表皮和维管束中的GUS信号；（C、G）超声处理50秒和侵染18分钟后可观察到强烈的GUS信号；（D、H）超声处理70秒和侵染18分钟的情况下，出现了致死性的微小伤口（黄色箭头标记为W）。
小远叨叨
文章至此就告一段落了！在本次的推文中小远主要是跟大家分享了一些有关提高农杆菌转化效率的文献案例，希望可以对大家的遗传转化工作有所启发。最后，再浅浅插播一条广告，我司目前可以为大家提供大豆、玉米、小麦、马铃薯等三十余种植物的遗传转化服务，有需要的小伙伴可以查询我司官网biorun.com或致电400-027-0273详询哦！
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